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摘要：目的探討丙泊酣對眶額葉皮層興奮性及相關學習記憶功能的影響。方法采用神經(jīng)藥理學方法在眶額葉皮層微注射丙泊酣，檢 測大鼠在T -迷宮中的反轉學習記憶功能及開場實驗中運動、情緒和探索動機的變化；通過免疫組化檢測c -fos表達,觀測丙泊酣對 眶額葉皮層神經(jīng)元興奮性的影響。結果眶額葉皮層微注射丙泊酣后，大鼠在T-迷宮中的學習記憶能力下降（P< 0.05);開場實驗中 眶額葉微注射丙泊酣未影響大鼠的運功、情緒及探索能力（P >0.05);丙泊酣可顯著抑制眶額葉皮層c-fos表達。結論丙泊酣可直接 抑制眶額葉皮層神經(jīng)元的活動，引起學習記憶能力下調，表明眶額葉皮層是丙泊酣發(fā)揮麻醉效應的重要靶區(qū)。
關鍵詞：丙泊酣；眶額葉皮層；反轉學習記憶;認知功能；大鼠
丙泊酚是臨床常用靜脈麻醉藥物[1-3]。研究表明， 丙泊酚麻醉后受試者不能維持覺醒，表現(xiàn)出學習記憶和 決策等認知功能下調[4-6]。目前，丙泊酚麻醉如何下調 學習記憶功能的神經(jīng)機制尚不*清楚。有研究表明， 丙泊酚可直接作用于學習記憶相關的海馬和內嗅皮層 腦區(qū)。在海馬區(qū)，丙泊酚可抑制神經(jīng)元興奮性，降低突觸 傳遞效率和可塑性，并抑制乙酰膽堿遞質釋放[7-11];同 時，下調內嗅皮層神經(jīng)元的活動[12]。眶額葉皮層興奮性 與覺醒程度密切相關，并對學習記憶、決策及執(zhí)行功能 起重要作用。在靈長類和嚙齒類動物中，損毀眶額葉皮層 可損害動物的反轉學習記憶功能和認知的靈活性[13 -16]。 采用正電子計算機斷層（PET)技術監(jiān)測人腦活動，發(fā)現(xiàn) 丙泊酚麻醉使眶額葉皮層活動下降,而對其他新皮 層作用較小[17],提示眶額葉與丙泊酚麻醉密切相關。本 研究中通過神經(jīng)藥理學、免疫組化及行為學檢測方法， 探討在眶額葉皮層微注射丙泊酚對學習記憶功能及神 經(jīng)元活動的影響，以期進_步闡明丙泊酚麻醉效應，特 別是麻醉中認知下調的神經(jīng)機制。現(xiàn)報道如下。
1材料與方法 1.1材料
動物與分組:健康雄性SD大鼠26只,2個月月齡, 清潔級，體質量250 ~ 300 g,雄性，購于陸junjun醫(yī)大學動 物中心，動物合格證號為SCXK(渝）-PLA-20160011, 實驗操作符合陸junjun醫(yī)大學動物倫理規(guī)范。行為實驗 中，共使用26只大鼠：14只大鼠隨機分為2組（溶劑對 照組和丙泊酚處理組，各7只，用于T -迷宮實驗監(jiān)測 反轉學習記憶；12只大鼠隨機分為2組（溶劑對照組和 丙泊酚處理組，各6只，用于開場實驗。
試藥：丙泊酚（批號為56931,分析純，純度& 98%),多聚甲醛（批號為16005,純度>98%),4',6- 二脒基-2 -苯基吲哚（DAPI),批號為D9542,純度& 98%),均購于美國Sigma公司；c-fos免疫組化染色的 —抗（批號為ab208942)和二抗（批號為ab150113)均購 于英國Abcam公司。
儀器：IVM - 1000型微量注射泵（英國 T-迷宮行為檢測裝置及配套動物軌跡視頻追蹤系統(tǒng)， 開場行為檢測設備及配套動物軌跡視頻追蹤系統(tǒng)（中國 上海欣軟信息科技公司）；CM 1900型冰凍切片機(德國 Leica ;腦立體定位儀（中國深圳瑞沃德公司）。
1.2. 1埋置給藥導管及微量給藥
將大鼠用3%戊巴bi妥鈉進行麻醉（每100 g體質 量0. 25 mL,腹腔注射），置腦立體定位儀，用酒精和碘 伏消毒后，剪開顱骨表面皮膚及去除軟組織，暴露顱骨。 用過氧化氫擦拭顱骨表面，暴露前囟和后囟點。明確眶 額葉額葉皮層定位坐標(anteroposterior: + 3. 7 mm, mid-dle - lateral. ± 2. 5 mm, dorsoventral. - 4. 0 mm) 。 根據(jù)上 述坐標，用牙科鉆制作下導管的骨孔，在骨孔周圍安裝 固定螺絲，完成后用微推將導管（中國深圳瑞沃德公司） 埋植于眶額葉皮層。用牙科水泥將固定螺絲和導管固 定。手術完成后，將大鼠置飼養(yǎng)籠恢復，恢復5 ~7d后 進行T-迷宮或開場實驗檢測。
采用微量注射泵進行微量給藥，在眶額葉給藥體積 為0.5 pL,丙泊酚的濃度為50pmol/L[12，18]。微量給藥 速度為每2 min 0. 5 pL,給約完成后留針2 min,使約物擴 散。給藥后15 min進行T -迷宮或開場實驗檢測。
限食：訓練前4 d進行食物攝取限制（每天給予大 鼠約10 ~ 15 g食物)，使大鼠體質量降至85%。
環(huán)境適應：在動物進行限食過程中，同時讓大鼠在 T迷宮中適應，讓動物在撒有食物粒的T -迷宮中自由 探索 8 ~ 10 min。
T-迷宮測試:T-迷宮主要由1個中心臂及2個選擇 臂構成(各臂長50 cm,寬20 cm)。共訓練10 d，前6 d將 食物固定于T -迷宮的左側，每天進行10次訓練，每次 間隔30 s。訓練時讓大鼠從中央臂的起點出發(fā)到左右的 選擇臂尋找食物（放于選擇臂末端）。訓練6 d后，將食 物放于T -迷宮的右側，繼續(xù)訓練4 d。每次訓練前，眶 額葉皮層給予溶劑或丙泊酚，給藥15 min后進行訓練。 動物若能準確找到食物，記錄1次正確的選擇;反之，則 記錄為1次錯誤的選擇。
開場為1 mx1 mx1 m的盒子（開口、黑色）。每只
大鼠僅接受1次測試，測試前15 min在眶額葉皮層給 藥。大鼠放于入開場的中心區(qū)域，自由探索5 min。利用 視頻追蹤系統(tǒng)檢測大鼠在開場中的運動距離、站立次 數(shù)、進入中心區(qū)域的次數(shù)及距離。
完成行為檢測后，采用生理鹽水(37 °C) +4%多聚 甲醛(4 癈 )進行灌注和固定。灌注固定后取腦組織。大 腦在4%多聚甲醛中固定，完成后轉移至30%蔗糖+ 4%多聚甲醛溶液中進行脫水。腦組織沉底后，進行冰凍 切片（厚度40 pm)。按冠狀面對眶額葉皮層連續(xù)切片， 對切片進行DAPI染色。完成后進行封片，在熒光顯微 鏡下檢測導管埋置位置是否位于眶額葉皮層。導管埋置 不準大鼠不納入統(tǒng)計。
按照1. 2. 1項下方法操作，在眶額葉皮層微量注射 溶劑和丙泊酚。為排除眶額葉皮層自身晝夜節(jié)律影響， 注射溶劑和丙泊酚在固定時間點(19:00)。完成注射90min 后，按照1.2.4項下方法進行灌注固定。將腦組織置 4%多聚甲醛外固定過夜，30 %蔗糖[磷酸緩沖鹽溶液 (PBS)配置]脫水過夜。切片30 pm,PBS中保存。一抗染 色，濃度 1 : 200, 4 C 24 h,室溫 2 h, PBS 漂洗 10 min, 共3次。DAPI染色5 min, 1 xPBS漂洗10 min 1次，二抗 避光染色，濃度為1 : 200, 2 h, 1 X PBS漂洗10 min 3次。貼片后80%甘油封片，顯微鏡下觀察眶額葉皮層 c - fos的表達。
1.3 統(tǒng)計學處理
采用SPSS 18. 0和Sigma Plot軟件分析。計量資料 用X± s表示，采用獨立樣本t檢驗。P< 0.05為差異 有統(tǒng)計學意義。
2 結果
2.1引起大鼠反轉學習能力受損
采用T -迷宮檢測大鼠反轉學習記憶能力（圖1 A)。 前6 d,將食物固定于T -迷宮的左側臂，隨著訓練的 天數(shù)增加，大鼠在T-迷宮中選擇正確率亦逐漸增加； 第6天，兩組動物選擇的正確率均達到80% (圖1 B); 隨后，檢測大鼠反轉學習記憶能力，在眶額葉皮層給藥 后，大鼠在反轉學習過程中選擇正確率顯著低于對照組 動物（圖1 B),表明丙泊酚可作用于眶額葉皮層損害大 鼠的反轉學習記憶能力。
2.2 對大鼠運動、探索動機和情緒行為無明顯效應 反轉學習也可能受到非特異性因素的干預,如情緒 和探索動機。眶額葉皮層微注射丙泊酚對大鼠在開場中 的運動距離和站立次數(shù)無明顯效應（圖2 A至圖2 C), 表明丙泊酚在眶額葉皮層并不影響大鼠的運動功能和 探索行為。同時，眶額葉皮層給予丙泊酚不影響大鼠進入開場中心區(qū)域的次數(shù)和運動距離（圖2D至圖2 E)， 可直接作用于
表明大鼠的焦慮情緒行為未受到影響。 眶額葉皮層，通 本欄目由
2.3 可降低眶額葉皮層神經(jīng)元的興奮性 過抑制該腦區(qū)宙八=1
采用免疫組化檢測c - fos蛋白表達,分析給藥后眶活動進而下調 額葉皮層神經(jīng)元興奮性的變化。給藥后眶額葉皮層熒光 學習記憶功能， 協(xié)辦
信號較弱，且c-fos陽性神經(jīng)元的數(shù)量顯著減少（圖3)， 表明眶額葉皮
表明丙泊酚可直接抑制眶額葉皮層神經(jīng)元的興奮性。
3 討論
丙泊酚麻醉導致覺醒不能維持，表現(xiàn)為認知功能嚴 重下調。在眶額葉局部微注射丙泊酚引起大鼠在T-迷 宮中的正確選擇率嚴重下降；開場實驗中，眶額葉皮層 微注射丙泊酚對大鼠的運動、情緒和探索動機無明顯效 應，可引起c -fos陽性神經(jīng)元數(shù)量減少。結果表明，丙泊 酚可直接抑制眶額葉皮層興奮性，引起警覺及認知功能 下調。
眶額葉皮層主要接受體感皮層、背縫核、邊緣皮層 和海馬的輸入，主要投射至前額葉和腹側被蓋區(qū)[19-21]。 靈長類動物中，損毀眶額葉皮層動物在學習記憶任務中 選擇的錯誤次數(shù)增多。嚙齒類動物中，抑制或損毀眶額 葉皮層可造成反轉學習記憶或認知的靈活性受損 反轉學習與眶額葉皮層神經(jīng)元放電編碼模式和神經(jīng)元 集群網(wǎng)絡振蕩密切相關。采用多通道記錄技術監(jiān)測眶額 葉皮層神經(jīng)元的放電，發(fā)現(xiàn)在反轉學習過程中，眶額葉 皮層神經(jīng)元放電能表征環(huán)境信號所預測的結果[23 -24]。 通過c - fos標記技術發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可能是通過下調眶額 葉皮層的神經(jīng)元興奮，抑制神經(jīng)元的特定編碼模式，進 而造成反轉學習功能受損。
在新皮層及皮層下區(qū)域，丙泊酚可直接作用于神經(jīng) 元的胞體，增強神經(jīng)元的鉀通道或抑制超極化激活非選 擇性陽離子通道，產(chǎn)生外向電流，導致神經(jīng)元發(fā)生超極 化，引起興奮性下降。丙泊酚同時可增強GABAA型受體 介導的抑制性輸入，間接地抑制神經(jīng)元活動[12,8,5-27]。但 本研究側重于行為學和形態(tài)學的觀察，丙泊酚調控眶額 葉皮層的離子通道機制尚不清楚，還需進一步研究。
丙泊酚作為常用麻醉藥物，具有起效快、蘇醒快的 特點，其麻醉的顯著特征為認知功能下調[4-5]。丙泊酚
